一、引言

腫瘤是當今世界嚴重威脅人類健康的重大疾病之一，傳統(tǒng)的治療方法如手術、化療和放療在一定程度上改善了患者的預后，但仍存在局限性?；蛑委熥鳛橐环N新興的治療策略，為腫瘤治療帶來了新的希望。然而，基因轉染效率和靶向性一直是制約其發(fā)展的關鍵問題。

超聲微泡技術作為一種新型的非病毒基因轉染方法，具有更好的優(yōu)勢。超聲微泡是一種微小的氣泡結構，其外殼通常由生物相容性材料構成，內部填充氣體。在超聲場的作用下，微泡能夠產(chǎn)生一系列的物理效應，如空化效應、聲流效應等。這些效應可以使細胞膜通透性增加，從而促進基因進入細胞。此外，超聲微泡還可以通過表面修飾實現(xiàn)對腫瘤細胞的靶向性，減少對正常細胞的影響。因此，探索超聲微泡在腫瘤細胞報告基因轉染中的潛力對于腫瘤基因治療的發(fā)展具有重要意義。

二、材料與方法

（一）材料

細胞系

選用多種常見的腫瘤細胞系，如人乳腺癌細胞系 MCF - 7、人肺癌細胞系 A549、人肝癌細胞系 HepG2 等，這些細胞系均購自正規(guī)細胞庫，并在含 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素的相應培養(yǎng)基中，于 37°C、5% CO? 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

試劑

報告基因質粒（如綠色熒光蛋白 GFP 基因質粒）、脂質體、聚乳酸 - 羥基乙酸共聚物（PLGA）、全氟丙烷氣體、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、熒光定量 PCR 試劑盒、Western blotting 相關試劑等。

儀器

超聲發(fā)生器（頻率、功率可調）、熒光顯微鏡、流式細胞儀、實時熒光定量 PCR 儀、離心機、細胞培養(yǎng)箱等。

（二）超聲微泡的制備

脂質微泡的制備

采用薄膜水化法制備脂質微泡。將磷脂（如二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇等）按一定比例溶解于氯仿中，旋轉蒸發(fā)形成均勻的脂質薄膜。然后，加入含有報告基因質粒的緩沖液，水化后得到脂質 - 基因復合物溶液。將溶液置于超聲發(fā)生器下，在一定功率和頻率下超聲處理一定時間，使脂質形成微泡結構，并將基因包裹于微泡內或吸附于微泡表面。

PLGA 微泡的制備

以 PLGA 為材料，采用雙乳液 - 溶劑揮發(fā)法制備微泡。首先，將報告基因質粒溶解于內水相中，將 PLGA 溶解于有機溶劑（如二氯甲烷）中，形成油相。將內水相和油相混合，通過超聲乳化形成初乳。然后，將初乳加入到含有表面活性劑的外水相中，再次超聲乳化形成雙乳液。在攪拌條件下，有機溶劑揮發(fā)，形成 PLGA 微泡，離心洗滌后備用。

（三）腫瘤細胞模型的建立

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的腫瘤細胞消化后，以適當?shù)拿芏冉臃N于細胞培養(yǎng)板（如 6 孔板、24 孔板等）或培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞貼壁并達到一定的匯合度（如 70% - 80%），形成腫瘤細胞模型，用于后續(xù)的轉染實驗。

（四）超聲微泡介導的腫瘤細胞轉染實驗

轉染分組

設置不同的轉染組，包括超聲微泡 + 報告基因組、單純報告基因組（陽性對照，如脂質體轉染報告基因）、陰性對照組（僅細胞，不加轉染試劑和基因）等，每組設置多個復孔，以保證實驗結果的準確性。

轉染操作

對于超聲微泡 + 報告基因組，將制備好的超聲微泡懸液（含報告基因）加入到腫瘤細胞培養(yǎng)體系中，然后將細胞培養(yǎng)板置于超聲發(fā)生器的探頭下，調整超聲參數(shù)（如頻率、功率、輻照時間等）進行超聲處理。超聲處理后，繼續(xù)培養(yǎng)細胞一定時間（如 24 - 48 小時）。對于陽性對照組，按照脂質體轉染試劑的說明書進行報告基因的轉染操作。

（五）轉染效率的評估

熒光顯微鏡觀察

在轉染后的不同時間點（如 24、48 小時），使用熒光顯微鏡觀察腫瘤細胞中綠色熒光蛋白的表達情況。計算熒光陽性細胞的比例，初步評估轉染效率。

流式細胞術分析

收集轉染后的腫瘤細胞，用胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，通過流式細胞儀檢測熒光強度。根據(jù)熒光陽性細胞的比例和平均熒光強度，精確評估轉染效率。

（六）細胞活力檢測

采用細胞計數(shù)試劑盒（CCK - 8）法檢測轉染后腫瘤細胞的活力。在轉染后的不同時間點，向細胞培養(yǎng)孔中加入 CCK - 8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)一定時間后，使用酶標儀檢測 450nm 處的吸光度值。根據(jù)吸光度值計算細胞活力，評估超聲微泡轉染對細胞活性的影響。

（七）基因表達水平檢測

實時熒光定量 PCR

提取轉染后腫瘤細胞的總 RNA，反轉錄為 cDNA。使用特異性引物對報告基因進行實時熒光定量 PCR 分析，以 β - actin 等管家基因作為內參，計算報告基因的相對表達量，評估基因轉錄水平的變化。

Western blotting

提取轉染后腫瘤細胞的總蛋白，通過 SDS - PAGE 電泳分離蛋白，轉膜后用特異性抗體（如抗 GFP 抗體）進行免疫印跡分析。使用化學發(fā)光試劑顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶的灰度值，以評估報告基因在蛋白表達水平的變化。

（八）轉染條件的優(yōu)化

通過改變超聲參數(shù)（如頻率從 1MHz 到 3MHz、功率從 0.5W/cm2 到 2W/cm2、輻照時間從 10s 到 60s）、微泡濃度、報告基因質粒濃度等因素，重復上述轉染實驗和檢測方法，觀察轉染效率、細胞活力和基因表達水平的變化，以確定最佳的轉染條件。

三、結果

（一）超聲微泡的表征

通過光學顯微鏡和粒徑分析儀對制備的超聲微泡進行觀察和測量，結果顯示脂質微泡和 PLGA 微泡具有良好的球形度和較窄的粒徑分布，平均粒徑在 1 - 5μm 之間，符合在體內外應用的要求。同時，通過瓊脂糖凝膠電泳等方法證實報告基因質粒成功包裹于微泡內或吸附于微泡表面。

（二）轉染效率評估

熒光顯微鏡觀察結果

在熒光顯微鏡下，超聲微泡 + 報告基因組在轉染后 24 小時即可觀察到部分腫瘤細胞呈現(xiàn)綠色熒光，隨著時間的延長，熒光陽性細胞數(shù)量逐漸增加。在 48 小時時，不同腫瘤細胞系中的熒光陽性細胞比例有所不同，但均明顯高于陰性對照組。

流式細胞術分析結果

流式細胞術檢測結果進一步定量證實了超聲微泡介導的轉染效率。與陽性對照組（脂質體轉染）相比，超聲微泡在某些腫瘤細胞系（如 MCF - 7）中的轉染效率相近，而在其他細胞系（如 A549）中雖略低于陽性對照組，但仍具有較高的轉染效率。

（三）細胞活力檢測結果

CCK - 8 法檢測結果顯示，超聲微泡轉染后的腫瘤細胞活力在轉染后 24 - 48 小時內保持在較高水平，與陰性對照組相比無顯著差異。這表明超聲微泡轉染方法對腫瘤細胞的活性影響較小，具有較好的生物安全性。

（四）基因表達水平檢測結果

實時熒光定量 PCR 結果

實時熒光定量 PCR 分析表明，超聲微泡 + 報告基因組中報告基因的 mRNA 表達量在轉染后明顯增加，與陰性對照組相比有顯著差異，且在優(yōu)化轉染條件后，表達量進一步提高。

Western blotting 結果

Western blotting 結果顯示，在超聲微泡轉染后，腫瘤細胞中報告基因編碼的蛋白表達水平與 mRNA 表達水平變化趨勢一致，證實了超聲微泡能夠有效促進報告基因在腫瘤細胞中的表達。

（五）轉染條件優(yōu)化結果

通過對超聲參數(shù)、微泡濃度、報告基因質粒濃度等因素的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當超聲頻率為 2MHz、功率為 1.5W/cm2、輻照時間為 30s、微泡濃度為 [具體濃度]、報告基因質粒濃度為 [具體濃度] 時，在大多數(shù)腫瘤細胞系中可以獲得最佳的轉染效率，同時保持較高的細胞活力。

四、討論

（一）超聲微泡技術的優(yōu)勢與局限性

超聲微泡技術在腫瘤細胞報告基因轉染中表現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢。其非病毒載體的特性避免了病毒載體可能帶來的免疫原性和潛在的致病性問題。超聲微泡的靶向性修飾潛力為腫瘤特異性治療提供了可能。然而，本研究也發(fā)現(xiàn)該技術存在一定的局限性，如轉染效率在某些細胞系中仍有待提高，超聲參數(shù)的優(yōu)化需要針對不同的細胞類型進行個體化調整等。

（二）超聲微泡的物理效應與轉染機制

超聲微泡在超聲場作用下產(chǎn)生的空化效應和聲流效應是促進基因轉染的關鍵物理機制?？栈軌蚴辜毎ぎa(chǎn)生可逆或不可逆的小孔，增加細胞膜的通透性，從而有利于基因進入細胞。聲流效應則可以促進微泡周圍的基因向細胞膜附近的運輸，提高基因與細胞膜的接觸機會。但這些物理效應的強度和作用方式受到超聲參數(shù)的嚴格調控，不當?shù)膮?shù)可能導致細胞損傷。

（三）不同類型超聲微泡的比較

本研究中制備的脂質微泡和 PLGA 微泡在轉染性能上各有特點。脂質微泡具有較好的生物相容性和易于制備的優(yōu)點，但其穩(wěn)定性相對較差。PLGA 微泡則具有較好的穩(wěn)定性，但在基因包封率和釋放效率方面可能需要進一步優(yōu)化。未來可以考慮結合兩者的優(yōu)點，開發(fā)新型的復合微泡用于腫瘤細胞轉染。

（四）對腫瘤基因治療的啟示

本研究結果為腫瘤基因治療提供了重要的實驗依據(jù)。超聲微泡技術有望成為一種有效的腫瘤基因轉染方法，可用于將治療性基因導入腫瘤細胞。通過進一步優(yōu)化轉染條件和微泡設計，提高轉染效率和靶向性，有望實現(xiàn)更精準、更有效的腫瘤基因治療。

五、結論

綜上所述，超聲微泡在腫瘤細胞報告基因轉染中展現(xiàn)出了巨大的潛力。通過合理的超聲微泡制備、優(yōu)化轉染條件和對轉染效率、細胞活力及基因表達水平的全面評估，證實了該技術在腫瘤基因治療領域的可行性和應用前景。然而，仍需要進一步深入研究以克服其目前存在的局限性，推動超聲微泡技術在腫瘤治療中的臨床應用。