一、引言

M2 受體作為一種重要的毒蕈堿型乙酰膽堿受體亞型，廣泛分布于心血管、平滑肌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種組織器官，在調(diào)節(jié)心率、平滑肌收縮和神經(jīng)遞質(zhì)釋放等生理過程中發(fā)揮關鍵作用。其功能異常與多種疾病，如心律失常、慢性阻塞性肺疾?。–OPD）和阿爾茨海默病等的發(fā)生發(fā)展密切相關。因此，對 M2 受體的研究一直是藥理學和生理學領域的熱點。

地黃是一種傳統(tǒng)的中藥材，其活性成分梓醇具有多種藥理作用，包括抗氧化、抗炎和神經(jīng)保護等。近年來，有研究提示梓醇可能與膽堿能系統(tǒng)存在相互作用，然而其對 M2 受體的具體影響尚未完整明確。為了深入探究地黃梓醇在 M2 受體相關生理病理過程中的作用，本研究利用轉基因 CHO 細胞模型進行深入研究，旨在揭示梓醇對 M2 受體功能和表達的調(diào)控機制。

二、材料與方法

（一）細胞系與試劑

細胞系

選用中國倉鼠卵巢（CHO）細胞系作為宿主細胞。該細胞系具有易于培養(yǎng)、遺傳背景清晰且可高效表達外源基因等優(yōu)點，廣泛應用于重組蛋白表達和受體研究。

試劑

地黃梓醇標準品（純度 > 98%）購自專業(yè)化學試劑公司。培養(yǎng)基為 DMEM/F12（含 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素）。轉染試劑采用脂質(zhì)體轉染試劑 Lipofectamine 2000，根據(jù)制造商的說明書進行操作。用于檢測 M2 受體表達的抗體包括 M2 受體特異性一抗（兔抗人 M2 受體多克隆抗體）和相應的熒光標記二抗（山羊抗兔 IgG - FITC）。其他試劑如磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰蛋白酶 - EDTA 消化液等均為分析純。

（二）轉基因 CHO 細胞模型的構建

目的基因獲取

從含有人類 M2 受體基因的質(zhì)粒載體中通過聚合酶鏈反應（PCR）擴增目的基因片段。設計特異性引物，確保擴增產(chǎn)物的準確性和完整性。PCR 反應條件經(jīng)過優(yōu)化，包括合適的退火溫度、延伸時間和循環(huán)次數(shù)，以獲得高產(chǎn)量和高質(zhì)量的目的基因片段。

轉染與篩選

將 CHO 細胞接種于 6 孔板中，待細胞生長至 70 - 80% 匯合度時進行轉染。將擴增得到的 M2 受體基因片段與脂質(zhì)體轉染試劑混合，形成轉染復合物。按照一定比例將復合物加入到細胞培養(yǎng)孔中，輕輕混勻后置于 37℃、5% CO? 的培養(yǎng)箱中孵育。轉染后 48 小時，加入含有 G418（一種抗生素，用于篩選成功轉染的細胞）的培養(yǎng)基進行篩選。持續(xù)篩選約 2 - 3 周，期間定期更換含 G418 的培養(yǎng)基，直至形成穩(wěn)定表達 M2 受體的轉基因 CHO 細胞株。

（三）細胞培養(yǎng)與處理

細胞培養(yǎng)

將篩選得到的轉基因 CHO 細胞株接種于 T25 培養(yǎng)瓶或 96 孔板、24 孔板等不同規(guī)格的培養(yǎng)器皿中，根據(jù)實驗需求確定接種密度。細胞培養(yǎng)于 37℃、5% CO? 的培養(yǎng)箱中，使用 DMEM/F12 培養(yǎng)基，每 2 - 3 天更換一次培養(yǎng)基，保持細胞處于良好的生長狀態(tài)。

梓醇處理

將地黃梓醇標準品用 DMSO（二甲基亞砜）溶解配制成高濃度儲備液，然后用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。在細胞培養(yǎng)至合適密度（如 80 - 90% 匯合度）時，加入不同濃度的梓醇溶液，設置多個濃度梯度（如 1μM、10μM、100μM 等）和對照組（僅加入等體積的 DMSO 溶劑）。處理時間分別為 24、48 和 72 小時，以觀察梓醇對 M2 受體的短期和長期影響。

（四）檢測方法

M2 受體表達檢測 - Western blotting

收集經(jīng)梓醇處理和對照組的細胞，用預冷的 PBS 洗滌兩次后，加入含有蛋白酶抑制劑的 RIPA 裂解液，冰上裂解 30 分鐘。裂解產(chǎn)物在 4℃下 12000rpm 離心 15 分鐘，取上清液作為蛋白樣品。采用 BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將等量的蛋白樣品進行 SDS - PAGE 電泳，然后轉印至 PVDF 膜上。用 5% 脫脂奶粉封閉膜 1 小時后，加入 M2 受體特異性一抗，4℃孵育過夜。次日，用 TBST 緩沖液洗滌膜 3 次，每次 10 分鐘，然后加入熒光標記二抗，室溫孵育 1 小時。再次用 TBST 緩沖液洗滌后，采用化學發(fā)光成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶的信號強度，以評估 M2 受體的表達水平。

M2 受體功能檢測 - 放射性配體結合實驗

采用放射性標記的 M2 受體特異性配體（如 [3H] - 甲基東莨菪堿）進行配體結合實驗。將經(jīng)梓醇處理和對照組的細胞用 PBS 洗滌后，加入含有不同濃度 [3H] - 甲基東莨菪堿的結合緩沖液（含有適量的 Mg2?和 Ca2?等離子），在一定溫度（如 25℃）下孵育一定時間（如 60 分鐘）。孵育結束后，通過快速過濾收集細胞，用冰冷的結合緩沖液洗滌多次，以去除未結合的配體。然后將濾膜放入閃爍液中，用液體閃爍計數(shù)器測定放射性強度。通過 Scatchard 分析計算 M2 受體的親和力（Kd 值）和最大結合容量（Bmax 值），以評估 M2 受體的功能狀態(tài)。

細胞內(nèi)信號通路檢測 - ELISA 法

由于 M2 受體激活可影響細胞內(nèi)多種信號通路，如抑制腺苷酸環(huán)化酶（AC）活性，導致細胞內(nèi) cAMP 水平降低。收集梓醇處理和對照組的細胞，按照 ELISA 試劑盒（用于檢測 cAMP 水平）的說明書操作，檢測細胞內(nèi) cAMP 的含量變化。同時，還可檢測其他相關信號分子（如 PKA、MAPK 等）的活性變化，以全面了解梓醇對 M2 受體相關信號通路的影響。

三、結果

（一）轉基因 CHO 細胞模型的鑒定

通過 PCR 和基因測序驗證了轉染細胞中 M2 受體基因的整合情況，結果表明成功構建了含有人類 M2 受體基因的轉基因 CHO 細胞株。在細胞免疫熒光染色實驗中，可見轉染細胞呈現(xiàn)明顯的 M2 受體特異性熒光信號，進一步證實了 M2 受體在 CHO 細胞表面的表達。

（二）梓醇對 M2 受體表達的影響

Western blotting 結果顯示，不同濃度的地黃梓醇處理轉基因 CHO 細胞不同時間后，M2 受體蛋白表達水平呈現(xiàn)出濃度 - 時間依賴性變化。在較低濃度（1 - 10μM）和短時間（24 小時）處理時，M2 受體表達略有增加；而在高濃度（100μM）和長時間（72 小時）處理后，M2 受體表達出現(xiàn)下降趨勢，表明梓醇對 M2 受體表達具有雙向調(diào)節(jié)作用。

（三）梓醇對 M2 受體功能的影響

放射性配體結合實驗結果表明，梓醇處理后 M2 受體的親和力（Kd 值）和最大結合容量（Bmax 值）發(fā)生了改變。在一定濃度范圍內(nèi)（1 - 10μM），梓醇使 M2 受體的親和力增加，而在高濃度（100μM）時親和力有所降低；最大結合容量在低濃度梓醇處理下無明顯變化，但在高濃度處理下顯著減少。這提示梓醇對 M2 受體的功能有復雜的調(diào)控作用，可能通過影響受體與配體的結合特性來實現(xiàn)。

（四）梓醇對 M2 受體相關信號通路的影響

ELISA 檢測結果顯示，梓醇處理后細胞內(nèi) cAMP 水平發(fā)生變化。在低濃度梓醇處理時，細胞內(nèi) cAMP 水平略有降低，與 M2 受體激活后抑制 AC 活性的生理效應相符；而在高濃度梓醇處理下，cAMP 水平出現(xiàn)異常變化，可能暗示高濃度梓醇對細胞內(nèi)信號通路產(chǎn)生了其他復雜的影響。同時，對其他信號分子（如 PKA、MAPK 等）活性的檢測也發(fā)現(xiàn)了相應的變化，進一步表明梓醇對 M2 受體相關信號網(wǎng)絡具有廣泛的調(diào)控作用。

四、討論

（一）地黃梓醇對 M2 受體的作用機制

本研究結果表明地黃梓醇對轉基因 CHO 細胞 M2 受體的表達和功能具有復雜的調(diào)控作用。在低濃度下，梓醇可能通過激活某些細胞內(nèi)信號通路，促進 M2 受體的表達和增強其與配體的親和力，從而模擬生理狀態(tài)下 M2 受體的激活過程。這種激活可能涉及到梓醇與細胞表面或細胞內(nèi)的特定靶點相互作用，進而影響受體的轉錄、翻譯或穩(wěn)定性。然而，在高濃度下，梓醇可能引發(fā)細胞內(nèi)的應激反應或其他代償機制，導致 M2 受體表達下調(diào)和功能異常。這可能與梓醇對細胞膜結構、細胞內(nèi)信號分子或其他相關蛋白的影響有關。

（二）與疾病相關性及潛在應用價值

鑒于 M2 受體在多種疾病中的重要作用，地黃梓醇對 M2 受體的調(diào)控作用具有潛在的臨床意義。在心律失常等與 M2 受體功能異常相關的疾病中，適當濃度的梓醇可能通過調(diào)節(jié) M2 受體功能，恢復正常的心臟節(jié)律。對于神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如阿爾茨海默病，梓醇對 M2 受體的影響可能與改善膽堿能神經(jīng)傳遞有關，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。此外，本研究結果也為開發(fā)基于 M2 受體調(diào)控的新型藥物提供了新的思路，可進一步探索梓醇類似物或其衍生物在治療相關疾病中的應用。

（三）研究的局限性與展望

盡管本研究在轉基因 CHO 細胞模型上取得了一定的成果，但仍存在一些局限性。首先，CHO 細胞雖然是一種常用的細胞模型，但與體內(nèi)的原代細胞仍存在差異，可能無法完整模擬 M2 受體在體內(nèi)的真實生理環(huán)境。未來研究可考慮采用原代心肌細胞或神經(jīng)細胞等更接近生理狀態(tài)的細胞模型進一步驗證梓醇的作用。其次，本研究主要關注了梓醇對 M2 受體本身及其直接相關信號通路的影響，對于梓醇在整個細胞網(wǎng)絡和機體水平的作用機制尚需深入研究。例如，梓醇是否通過影響其他受體或細胞間通訊來間接調(diào)控 M2 受體功能等問題需要進一步探索。此外，在藥物研發(fā)方面，還需要進一步優(yōu)化梓醇的結構，提高其對 M2 受體的選擇性和作用效果，同時評估其安全性和藥代動力學特性。

五、結論

本研究利用轉基因 CHO 細胞模型深入探討了地黃梓醇對 M2 受體的影響。結果表明梓醇對 M2 受體的表達、功能和相關信號通路具有濃度 - 時間依賴性的復雜調(diào)控作用。這些發(fā)現(xiàn)為進一步理解地黃梓醇的藥理作用機制以及開發(fā)基于 M2 受體調(diào)控的治療策略提供了重要的實驗依據(jù)。然而，未來仍需要更深入和全面的研究來完善對梓醇 - M2 受體相互作用的認識，并將其更好地應用于臨床實踐。