一、引言

染色體異常是導(dǎo)致胎兒先天畸形、智力低下、發(fā)育遲緩等多種不良妊娠結(jié)局的重要原因之一。產(chǎn)前診斷對(duì)于發(fā)現(xiàn)染色體異常胎兒，為家庭和臨床提供決策依據(jù)具有至關(guān)重要的作用。傳統(tǒng)的染色體核型分析是產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法存在操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)（一般需要數(shù)天至數(shù)周）等缺點(diǎn)，尤其是對(duì)于急需診斷結(jié)果的孕婦（如孕周較大等情況）并不十分理想。

熒光原位雜交（FISH）技術(shù)作為一種分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，具有快速、靈敏、特異性高的特點(diǎn)，能夠在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)羊水細(xì)胞中的特定染色體異常進(jìn)行檢測(cè)。它可以檢測(cè)染色體的數(shù)目異常，如 21 - 三體、18 - 三體、13 - 三體等，以及部分染色體結(jié)構(gòu)異常。近年來(lái)，F(xiàn)ISH 技術(shù)在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，為染色體異常的早期診斷提供了一種有效的手段，大大提高了產(chǎn)前診斷的效率和質(zhì)量。

二、熒光原位雜交技術(shù)原理

FISH 技術(shù)是基于核酸分子雜交原理。它利用已知序列的熒光標(biāo)記核酸探針與細(xì)胞內(nèi)的染色體 DNA 進(jìn)行特異性雜交。這些探針可以特異性地識(shí)別染色體上特定的基因序列或區(qū)域。當(dāng)探針與目標(biāo) DNA 序列互補(bǔ)結(jié)合后，在熒光顯微鏡下可以觀察到熒光信號(hào)。通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)的數(shù)量、位置和分布等特征的分析，可以判斷染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)是否正常。

例如，對(duì)于檢測(cè) 21 - 三體綜合征，可以使用針對(duì) 21 號(hào)染色體特異性的探針。正常細(xì)胞中，在熒光顯微鏡下會(huì)觀察到兩個(gè)特定的熒光信號(hào)（對(duì)應(yīng)兩條 21 號(hào)染色體），而如果是 21 - 三體細(xì)胞，則會(huì)觀察到三個(gè)熒光信號(hào)。

三、實(shí)驗(yàn)材料與方法

（一）羊水樣本采集

羊水樣本一般在孕中期（16 - 22 周）通過(guò)羊膜腔穿刺術(shù)獲取。在超聲引導(dǎo)下，將穿刺針經(jīng)腹壁、子宮壁刺入羊膜腔，抽取一定量（一般 10 - 20ml）的羊水。采集過(guò)程中要嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則，以防止感染。采集后的羊水應(yīng)立即送檢，避免長(zhǎng)時(shí)間放置導(dǎo)致細(xì)胞活性降低。

（二）羊水細(xì)胞處理

1. 離心分離
將采集到的羊水樣本在低溫離心機(jī)中以適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速（如 1000 - 1500rpm）離心 10 - 15 分鐘，使羊水細(xì)胞沉淀在離心管底部。

2. 細(xì)胞培養(yǎng)（可選）
對(duì)于需要進(jìn)一步培養(yǎng)以獲得更多細(xì)胞的情況，可以將沉淀的羊水細(xì)胞接種到特定的培養(yǎng)基中，在合適的培養(yǎng)條件（37℃、5% CO?）下培養(yǎng)數(shù)天。培養(yǎng)后的細(xì)胞可以獲得更好的細(xì)胞形態(tài)和更多的染色體信息，但這會(huì)增加診斷時(shí)間。在一些緊急情況下，可以直接使用未經(jīng)培養(yǎng)的羊水細(xì)胞進(jìn)行 FISH 檢測(cè)。

3. 細(xì)胞固定
無(wú)論是培養(yǎng)后的細(xì)胞還是直接離心獲得的細(xì)胞，都需要進(jìn)行固定處理。常用的固定劑為甲醇 - 冰醋酸（3:1）混合液。將細(xì)胞懸浮在固定劑中，反復(fù)固定幾次，以保證細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，染色體形態(tài)清晰，便于后續(xù)雜交操作。

（三）探針選擇與標(biāo)記

1. 探針類型
根據(jù)需要檢測(cè)的染色體異常類型選擇合適的探針。常見(jiàn)的探針包括染色體著絲粒探針、染色體特異性位點(diǎn)探針和全染色體涂抹探針等。例如，對(duì)于常見(jiàn)的三體綜合征診斷，常使用著絲粒探針。對(duì)于檢測(cè)染色體易位等結(jié)構(gòu)異常，可以使用特異性位點(diǎn)探針或全染色體涂抹探針。

2. 探針標(biāo)記
探針標(biāo)記有直接標(biāo)記和間接標(biāo)記兩種方式。直接標(biāo)記是將熒光素（如 FITC、Cy3、Cy5 等）直接連接到探針上。間接標(biāo)記則是先將生物素等標(biāo)記物連接到探針上，然后在雜交后通過(guò)與熒光標(biāo)記的親和物質(zhì)（如熒光標(biāo)記的抗生物素抗體或抗抗體）反應(yīng)來(lái)顯示熒光信號(hào)。直接標(biāo)記操作相對(duì)簡(jiǎn)單，而間接標(biāo)記可以通過(guò)信號(hào)放大提高檢測(cè)靈敏度。

（四）雜交過(guò)程

1. 預(yù)處理
將固定好的羊水細(xì)胞涂片或滴片在適當(dāng)?shù)念A(yù)處理液（如 70% 甲酰胺 / 2×SSC）中處理，使染色體 DNA 變性，成為單鏈狀態(tài)，便于與探針雜交。處理溫度和時(shí)間需要嚴(yán)格控制，一般在 70 - 75℃處理數(shù)分鐘。

2. 雜交反應(yīng)
將標(biāo)記好的探針與預(yù)處理后的羊水細(xì)胞樣本混合，滴加到載玻片上，蓋上蓋玻片，在合適的雜交溫度（一般 37℃）下進(jìn)行雜交反應(yīng)。雜交反應(yīng)時(shí)間根據(jù)探針類型和長(zhǎng)度不同而有所差異，一般需要數(shù)小時(shí)至過(guò)夜。在雜交過(guò)程中，探針與染色體上的目標(biāo) DNA 序列特異性結(jié)合。

（五）檢測(cè)與結(jié)果分析

1. 洗滌
雜交完成后，需要進(jìn)行嚴(yán)格的洗滌步驟，以去除未結(jié)合的探針。洗滌液一般采用不同濃度的 SSC 溶液和吐溫 - 20。通過(guò)逐步降低鹽濃度和溫和的洗滌劑作用，將非特異性結(jié)合的探針洗脫，而保留特異性結(jié)合的探針。

2. 熒光顯微鏡觀察
將洗滌后的載玻片在熒光顯微鏡下觀察。使用合適的濾光片來(lái)激發(fā)和檢測(cè)不同熒光標(biāo)記的信號(hào)。觀察細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)的數(shù)量、位置和形態(tài)。對(duì)于染色體數(shù)目異常的診斷，根據(jù)特定染色體探針的熒光信號(hào)數(shù)量進(jìn)行判斷。例如，正常細(xì)胞中針對(duì)某條染色體的兩個(gè)熒光信號(hào)，若出現(xiàn)三個(gè)或更多，則提示該染色體數(shù)目異常。對(duì)于結(jié)構(gòu)異常，觀察熒光信號(hào)的分布和形態(tài)變化，如染色體易位可能導(dǎo)致兩個(gè)不同染色體的熒光信號(hào)在空間上出現(xiàn)異常的連接或融合。

3. 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)
建立嚴(yán)格的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)非常重要。對(duì)于熒光信號(hào)的強(qiáng)度、清晰度和特異性都要有明確的界定。一般要求熒光信號(hào)明亮、清晰，與背景有明顯區(qū)別。同時(shí)，要對(duì)多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行觀察和分析，以減少假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。對(duì)于一些臨界結(jié)果，可能需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)或結(jié)合其他診斷方法進(jìn)一步確認(rèn)。

四、FISH 技術(shù)在診斷染色體異常中的應(yīng)用

（一）常見(jiàn)染色體數(shù)目異常診斷

21 - 三體綜合征（唐氏綜合征）
使用 21 號(hào)染色體著絲粒探針進(jìn)行 FISH 檢測(cè)，可以快速準(zhǔn)確地檢測(cè)羊水細(xì)胞中的 21 - 三體情況。與傳統(tǒng)核型分析相比，F(xiàn)ISH 技術(shù)可以在 24 - 48 小時(shí)內(nèi)得出結(jié)果，大大縮短了診斷時(shí)間。在臨床實(shí)踐中，對(duì)于高齡孕婦或唐篩高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的羊水樣本，F(xiàn)ISH 檢測(cè)為及時(shí)發(fā)現(xiàn) 21 - 三體胎兒提供了有力支持。

18 - 三體綜合征（愛(ài)德華茲綜合征）和 13 - 三體綜合征（帕陶綜合征）
類似地，針對(duì) 18 號(hào)和 13 號(hào)染色體的著絲粒探針也可用于檢測(cè)相應(yīng)的三體綜合征。這些染色體異常往往伴隨著嚴(yán)重的胎兒畸形和發(fā)育障礙，早期診斷可以為家庭和醫(yī)生提供決策依據(jù)，如是否選擇終止妊娠等。

（二）染色體結(jié)構(gòu)異常診斷

1. 染色體易位
對(duì)于一些攜帶染色體平衡易位的夫婦，其胎兒有一定的染色體異常風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)使用特異性位點(diǎn)探針或全染色體涂抹探針，可以檢測(cè)羊水細(xì)胞中是否存在染色體易位情況。例如，在檢測(cè)羅伯遜易位時(shí)，FISH 技術(shù)可以清晰地顯示兩條近端著絲粒染色體之間的融合情況，幫助判斷胎兒是否遺傳了易位染色體，以及是否存在不平衡易位導(dǎo)致的基因缺失或重復(fù)。

2. 染色體缺失和重復(fù)
某些染色體微缺失和微重復(fù)綜合征（如 DiGeorge 綜合征、Prader - Willi 綜合征等）與特定染色體區(qū)域的基因缺失或重復(fù)有關(guān)。通過(guò)選擇覆蓋這些關(guān)鍵區(qū)域的探針，F(xiàn)ISH 技術(shù)可以檢測(cè)羊水細(xì)胞中是否存在相應(yīng)的染色體異常。這種檢測(cè)對(duì)于那些有家族遺傳病史或超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常的情況尤為重要。

五、FISH 技術(shù)與傳統(tǒng)染色體核型分析的比較

（一）優(yōu)勢(shì)

1. 快速診斷
FISH 技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)（一般 1 - 2 天）得出結(jié)果，而傳統(tǒng)核型分析需要較長(zhǎng)時(shí)間（一般 7 - 14 天）。這對(duì)于孕周較大、需要盡快得到診斷結(jié)果的孕婦非常有利，可以及時(shí)采取相應(yīng)的措施。

2. 特異性高
由于使用的是特異性探針，FISH 技術(shù)對(duì)于特定染色體異常的檢測(cè)具有很高的特異性。尤其是對(duì)于常見(jiàn)的三體綜合征等，其診斷準(zhǔn)確性與傳統(tǒng)核型分析相當(dāng)。

3. 可檢測(cè)染色體微小異常
對(duì)于一些染色體微缺失和微重復(fù)等微小結(jié)構(gòu)異常，FISH 技術(shù)在選擇合適探針的情況下能夠進(jìn)行檢測(cè)，而傳統(tǒng)核型分析可能由于分辨率的限制而難以發(fā)現(xiàn)。

（二）局限性

1. 檢測(cè)范圍有限
FISH 技術(shù)只能檢測(cè)已知序列的特定染色體異常，需要根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)的探針來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。如果存在未知的染色體異常或探針未覆蓋的區(qū)域異常，則可能會(huì)漏診。而傳統(tǒng)核型分析可以對(duì)整個(gè)染色體組進(jìn)行全面觀察。

2. 結(jié)果解讀相對(duì)復(fù)雜
FISH 技術(shù)的結(jié)果解讀需要對(duì)熒光信號(hào)有準(zhǔn)確的判斷，對(duì)于一些信號(hào)不清晰或復(fù)雜的情況（如嵌合體等），解讀難度較大。而且不同實(shí)驗(yàn)室之間可能存在一定的結(jié)果判斷差異，需要建立標(biāo)準(zhǔn)化的操作和解讀流程。

六、臨床案例分析

（一）病例資料

某孕婦，38 歲，孕 20 周，唐篩結(jié)果顯示 21 - 三體高風(fēng)險(xiǎn)。超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒頸部透明層增厚。經(jīng)羊膜腔穿刺獲取羊水樣本進(jìn)行 FISH 檢測(cè)和傳統(tǒng)核型分析。

（二）檢測(cè)過(guò)程與結(jié)果

1. FISH 檢測(cè)
使用 21 號(hào)染色體著絲粒探針進(jìn)行 FISH 檢測(cè)，在羊水細(xì)胞中觀察到三個(gè)明亮的熒光信號(hào)，提示 21 - 三體可能。整個(gè) FISH 檢測(cè)過(guò)程在 24 小時(shí)內(nèi)完成。

2. 傳統(tǒng)核型分析
同時(shí)進(jìn)行的傳統(tǒng)核型分析在 10 天后得出結(jié)果，確診為 21 - 三體綜合征。

（三）討論

在這個(gè)案例中，FISH 技術(shù)快速地為臨床提供了初步診斷結(jié)果，為后續(xù)的咨詢和決策提供了及時(shí)的信息。雖然傳統(tǒng)核型分析是確診的金標(biāo)準(zhǔn)，但 FISH 技術(shù)的快速診斷優(yōu)勢(shì)在這種情況下顯得尤為重要，可以避免孕婦長(zhǎng)時(shí)間的焦慮等待。同時(shí)，兩者結(jié)果的一致性也證明了 FISH 技術(shù)在 21 - 三體診斷中的可靠性。

七、結(jié)論

熒光原位雜交技術(shù)在羊水細(xì)胞染色體異常診斷中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。它以其快速、靈敏、特異性高的特點(diǎn)，為產(chǎn)前診斷染色體異常尤其是常見(jiàn)的三體綜合征和部分結(jié)構(gòu)異常提供了一種有效的檢測(cè)手段。雖然該技術(shù)存在一定的局限性，但與傳統(tǒng)染色體核型分析相結(jié)合，可以大大提高產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確性和效率。在臨床實(shí)踐中，應(yīng)根據(jù)孕婦的具體情況（如孕周、唐篩結(jié)果、超聲檢查結(jié)果等）合理選擇診斷方法，充分發(fā)揮 FISH 技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，為降低染色體異常患兒的出生率、提高人口素質(zhì)做出貢獻(xiàn)。隨著 FISH 技術(shù)的不斷發(fā)展，如新型探針的開(kāi)發(fā)、檢測(cè)流程的優(yōu)化等，其在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的應(yīng)用前景將更加廣闊。同時(shí)，也需要進(jìn)一步加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和人員培訓(xùn)，以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。