本研究聚焦于開發(fā)一種創(chuàng)新的基于電阻抗譜的摩擦納米電穿孔定量法，旨在攻克傳統(tǒng)電穿孔檢測(cè)手段在精準(zhǔn)性、實(shí)時(shí)性與定量分析層面的局限。借助精心設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)體系，融合微納加工、電學(xué)測(cè)試及細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建出摩擦納米電發(fā)生器驅(qū)動(dòng)電穿孔并同步采集電阻抗信號(hào)的平臺(tái)。通過對(duì)多種細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)，深入剖析電阻抗頻譜特征參數(shù)與電穿孔程度的量化關(guān)聯(lián)，揭示電穿孔動(dòng)態(tài)進(jìn)程中膜通透性、離子流變化規(guī)律。該方法創(chuàng)新性地達(dá)成高靈敏、無損且定量監(jiān)測(cè)，為基因轉(zhuǎn)染、藥物遞送等生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中電穿孔優(yōu)化提供關(guān)鍵技術(shù)支撐，有力推動(dòng)跨膜運(yùn)輸機(jī)制闡釋及相關(guān)生物技術(shù)革新。
在生物醫(yī)學(xué)前沿領(lǐng)域，電穿孔技術(shù)作為一種強(qiáng)效操控細(xì)胞通透性、助力外源物質(zhì)跨膜運(yùn)輸?shù)氖侄?，于基因治療、藥物靶向遞送等范疇扮演舉足輕重角色。傳統(tǒng)電穿孔評(píng)估多依賴顯微鏡觀測(cè)、熒光標(biāo)記追蹤等，然而這些方式或受限于時(shí)空分辨率，僅捕捉特定時(shí)刻靜態(tài)畫面；或因標(biāo)記流程繁雜、對(duì)細(xì)胞生理干擾大，難以精準(zhǔn)、連續(xù)反映電穿孔動(dòng)態(tài)全貌，尤其在定量解析電穿孔程度、速率及長(zhǎng)期穩(wěn)定性等關(guān)鍵指標(biāo)上力不從心。
摩擦納米發(fā)電機(jī)（TENG）的問世，以其 更好機(jī)械能 - 電能轉(zhuǎn)換效能、便攜靈活優(yōu)勢(shì)，革新微觀能量供給模式。將其與電穿孔有機(jī)融合成摩擦納米電穿孔體系，有望借摩擦起電誘發(fā)可控電脈沖驅(qū)動(dòng)物質(zhì)跨膜，更開啟原位、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)新路徑。電阻抗譜技術(shù)恰似微觀世界 “聽診器"，細(xì)胞電生理狀態(tài)細(xì)微異動(dòng)會(huì)映射于阻抗頻譜，憑借測(cè)量細(xì)胞在多頻交流電場(chǎng)下阻抗變化，能無損探知膜結(jié)構(gòu)、胞內(nèi)離子濃度等隱秘信息，契合電穿孔進(jìn)程精準(zhǔn)量化訴求。本研究由此立意，深挖基于電阻抗譜的摩擦納米電穿孔定量法，欲為細(xì)胞微觀操控與分析筑牢新技術(shù)基石。
細(xì)胞系選取 ：精心挑選具代表性哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，涵蓋人胚腎細(xì)胞（HEK293）、乳腺癌細(xì)胞（MCF - 7）及小鼠成纖維細(xì)胞（NIH/3T3），確保實(shí)驗(yàn)普適性與生物醫(yī)學(xué)關(guān)聯(lián)緊密性。上述細(xì)胞購(gòu)自細(xì)胞庫，依規(guī)范復(fù)蘇、培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素的 DMEM 高糖培養(yǎng)基，置于 37°C、5% CO?飽和濕度培養(yǎng)箱，定期傳代維持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期活力。
TENG 器件制備 ：采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）與聚四氟乙烯（PTFE）為摩擦電對(duì)材料，經(jīng)光刻、軟刻蝕微納加工，構(gòu)建出接觸分離式 TENG。PDMS 薄膜依標(biāo)準(zhǔn)配比固化于硅片模具，PTFE 經(jīng)裁切、等離子體處理調(diào)控表面功函數(shù)，二者貼合組裝，外接可精確調(diào)控負(fù)載與電學(xué)采集電路，保障穩(wěn)定摩擦起電與電脈沖輸出，輸出電壓范圍 0 - 500 V、頻率 0.1 - 10 Hz 可調(diào)。
設(shè)計(jì)定制集摩擦納米電穿孔、電阻抗譜測(cè)量于一體多功能測(cè)試平臺(tái)（圖 1）。核心為微流控芯片，中央微腔室（100 μL 容積）以聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）熱壓成型，嵌入鉑絲電極用于電穿孔脈沖施加與阻抗信號(hào)采集，兩側(cè)微通道銜接進(jìn)樣、廢液池，保障細(xì)胞懸液穩(wěn)定灌流。芯片安置于高精度三維移動(dòng)臺(tái)，上方懸置 TENG，借機(jī)械傳動(dòng)精確調(diào)控接觸距離、壓力，確保每次摩擦起電一致性；電學(xué)端與阻抗分析儀（Keysight E4990A，頻率 100 Hz - 10 MHz）、示波器（Tektronix MDO3000）互聯(lián)，實(shí)現(xiàn)多參數(shù)同步記錄。
細(xì)胞懸液準(zhǔn)備與芯片加載 ：胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，重懸于電穿孔緩沖液（含 1 mM MgCl?、10 mM HEPES、140 mM NaCl，pH 7.4），調(diào)整密度至 1×10? cells/mL，微量進(jìn)樣器注入芯片微腔室，靜置 15 min 使細(xì)胞貼壁附著。
摩擦納米電穿孔操作與阻抗測(cè)量 ：設(shè)置 TENG 初始參數(shù)（如 200 V 電壓、2 Hz 頻率）啟動(dòng)工作，觸發(fā)電穿孔；同步阻抗分析儀以 10 mV 交流激勵(lì)，掃頻采集電穿孔進(jìn)程阻抗數(shù)據(jù)，每 30 s 重復(fù)測(cè)量一輪，持續(xù) 15 min，記錄多頻點(diǎn)（1 kHz、10 kHz、100 kHz 等）阻抗幅值、相位信息；過程中以顯微鏡旁軸觀測(cè)細(xì)胞形態(tài)大體變化輔助驗(yàn)證。
對(duì)照實(shí)驗(yàn)設(shè)置 ：設(shè)未施加電穿孔 “空白對(duì)照" 組、傳統(tǒng)電穿孔儀（Bio - Rad Gene Pulser Xcell）電穿孔 “陽性對(duì)照" 組，依相似流程操作、測(cè)量，確保本方法效能評(píng)估客觀性與特異性。
電穿孔伊始，高頻段（1 MHz - 10 MHz）阻抗幅值驟降（圖 2），源于細(xì)胞膜電容特性主導(dǎo)，電穿孔致膜電容增大（新孔洞形成等同新增電容支路），依阻抗公式
（
為角頻率、
為電容），高頻阻抗銳減，反映膜結(jié)構(gòu)瞬間 “破綻"；中頻（100 kHz - 1 MHz）相位角延遲漸顯，暗示胞內(nèi)離子經(jīng)孔道外流、胞外離子內(nèi)滲，改變胞內(nèi)電導(dǎo)率，依 Cole - Cole 模型，離子遷移弛豫時(shí)間延長(zhǎng)致相位異動(dòng)；低頻段（100 Hz - 100 kHz）阻抗幅值平緩上升，歸因?yàn)榘麅?nèi)大分子、細(xì)胞器受離子濃度波動(dòng)影響，重新分布調(diào)整對(duì)電場(chǎng)響應(yīng)，整體呈現(xiàn)低頻 “電學(xué)慣性" 增強(qiáng)態(tài)勢(shì)。不同細(xì)胞系因膜脂質(zhì)組成、蛋白含量差異，阻抗變化幅度、速率有別，如 HEK293 高頻降阻更陡、MCF - 7 低頻升阻稍緩，契合細(xì)胞固有生理特質(zhì)。
定義 “電穿孔指數(shù)（EI）" 綜合表征電穿孔程度，經(jīng)主成分分析融合多頻阻抗特征量（幅值、相位權(quán)重因子依貢獻(xiàn)度分配）得 EI 量化值，與傳統(tǒng)熒光標(biāo)記法測(cè)細(xì)胞攝取熒光素鈉（反映膜通透性）量值擬合（圖 3），呈顯著線性正相關(guān)（
2 ），驗(yàn)證本方法定量精準(zhǔn)性；繪制 EI 隨時(shí)間動(dòng)態(tài)曲線，各細(xì)胞系電穿孔 2 - 3 min 達(dá)峰值，后續(xù)依細(xì)胞修復(fù)機(jī)制漸歸穩(wěn)態(tài)，NIH/3T3 修復(fù)最慢、EI 衰減半衰期約 8 min，遠(yuǎn)超 HEK293（5 min），為基因轉(zhuǎn)染 “窗口期" 把控提供關(guān)鍵時(shí)效參數(shù)，助益優(yōu)化外源基因?qū)霑r(shí)機(jī)。
對(duì)比傳統(tǒng)電穿孔檢測(cè)，本方法無需熒光染料、放射性標(biāo)記，規(guī)避標(biāo)記物干擾與潛在細(xì)胞毒性，契合綠色安全實(shí)驗(yàn)需求；每秒多次阻抗采集，實(shí)時(shí)追蹤電穿孔各階段，時(shí)空分辨率躍升，捕捉瞬態(tài) “電穿孔脈沖" 與細(xì)胞響應(yīng)；且對(duì)不同細(xì)胞、電穿孔條件普適性佳，適配多元生物醫(yī)學(xué)場(chǎng)景，如依阻抗反饋實(shí)時(shí)調(diào) TENG 參數(shù)，精準(zhǔn)控電穿孔強(qiáng)度，在難轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因編輯中顯著提升轉(zhuǎn)染效率（相較于傳統(tǒng)法提升 30% - 40%），為高效細(xì)胞工程作業(yè)筑牢根基。
本研究所創(chuàng)基于電阻抗譜的摩擦納米電穿孔定量法，憑借創(chuàng)新技術(shù)融合與精細(xì)實(shí)驗(yàn)探究，解鎖電穿孔微觀進(jìn)程 “量化密碼"，從阻抗頻譜異動(dòng)精準(zhǔn)映射電穿孔動(dòng)態(tài)軌跡，多維度量化剖析電穿孔程度、時(shí)效特征，為細(xì)胞跨膜運(yùn)輸調(diào)控提供銳利工具。未來，隨技術(shù)迭代升級(jí)，有望嵌入智能化生物芯片，于單細(xì)胞精準(zhǔn)治療、合成生物學(xué)復(fù)雜體系構(gòu)建發(fā)揮更大效能，持續(xù)深挖細(xì)胞電生理奧秘，賦能生物醫(yī)學(xué)底層創(chuàng)新，拓寬生命微觀操控邊界。
