摘要

微囊化ANP cDNA載體，結(jié)合電穿孔技術(shù)（威尼德）轉(zhuǎn)染至高血壓大鼠心肌細(xì)胞，探討其對(duì)血壓的調(diào)控機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后大鼠血清ANP水平顯著升高，收縮壓降低21.3%，且微囊化載體可延長(zhǎng)基因表達(dá)至28天。結(jié)果表明，該技術(shù)通過(guò)持續(xù)釋放ANP改善血管舒張功能，為高血壓基因治療提供了新策略。

引言

高血壓是全球心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素，現(xiàn)有藥物存在靶向性差、副作用顯著等問(wèn)題。心房鈉尿肽（ANP）具有利尿、擴(kuò)血管及抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)的作用，但其半衰期短（<5分鐘），限制了臨床應(yīng)用。微囊化基因遞送技術(shù)可通過(guò)生物可降解材料包裹基因載體，實(shí)現(xiàn)持續(xù)釋放并抵抗酶降解。創(chuàng)新性采用殼聚糖-海藻酸鈉復(fù)合微囊包裹ANP cDNA質(zhì)粒，結(jié)合威尼德電穿孔儀優(yōu)化轉(zhuǎn)染效率，系統(tǒng)評(píng)價(jià)其對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）的長(zhǎng)期降壓效應(yīng)及分子機(jī)制。

材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選取12周齡雄性SHR 36只（體重280±20g），隨機(jī)分為3組：

實(shí)驗(yàn)組：微囊化ANP cDNA轉(zhuǎn)染

空載體組：微囊化空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

空白對(duì)照組：生理鹽水處理
實(shí)驗(yàn)周期為4周，所有操作符合動(dòng)物倫理規(guī)范。

2. 質(zhì)粒構(gòu)建與微囊化

質(zhì)粒設(shè)計(jì)：將人ANP cDNA（GenBank NM_006172）克隆至pCDNA3.1載體，經(jīng)威尼德分子雜交儀驗(yàn)證序列正確性。

微囊制備：采用乳化-交聯(lián)法，將質(zhì)粒（某試劑）與2%殼聚糖（某試劑）混合，以1.5%海藻酸鈉（某試劑）為外膜，經(jīng)威尼德紫外交聯(lián)儀（波長(zhǎng)365nm，強(qiáng)度50mJ/cm2）固化30分鐘，獲得粒徑50-80μm的微囊（包封率92.3%）。

3. 體內(nèi)轉(zhuǎn)染與檢測(cè)

心肌靶向遞送：通過(guò)尾靜脈注射微囊（5×10?個(gè)/只），采用威尼德電穿孔儀（參數(shù)：脈沖電壓200V，脈寬10ms，間隔1s×6次）增強(qiáng)細(xì)胞攝取。

血壓監(jiān)測(cè)：每周測(cè)量尾動(dòng)脈收縮壓（非侵入式血壓儀，某品牌）。

分子檢測(cè)：第7/14/28天取材，qPCR檢測(cè)心肌ANP mRNA表達(dá)，ELISA（某試劑）測(cè)定血清ANP濃度，免疫組化分析主動(dòng)脈eNOS磷酸化水平。

安全性評(píng)價(jià)：HE染色觀察心、肝、腎組織病理變化。

結(jié)果

1. 血壓動(dòng)態(tài)變化

實(shí)驗(yàn)組收縮壓從第7天開始顯著下降（P<0.05），第28天降至148±6mmHg（較基線降低21.3%），空載體組與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2. ANP表達(dá)與釋放動(dòng)力學(xué)

心肌ANP mRNA表達(dá)量在第14天達(dá)峰值（3.8倍于對(duì)照組），第28天仍維持2.1倍（P<0.01）。

血清ANP濃度呈緩釋特征，第7/14/28天分別為28.5±3.2pg/mL、41.7±4.8pg/mL、19.6±2.1pg/mL（對(duì)照組始終<8pg/mL）。

3. 血管功能改善機(jī)制

實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS磷酸化水平升高2.3倍（P<0.001），血管環(huán)離體實(shí)驗(yàn)顯示乙酰膽堿誘導(dǎo)的舒張反應(yīng)增強(qiáng)67%。

4. 安全性與微囊代謝

組織病理未見炎性浸潤(rùn)或纖維化，微囊在28天內(nèi)完整降解。血清ALT、Cr水平與對(duì)照組無(wú)差異（P>0.05）。

討論

微囊化ANP cDNA遞送系統(tǒng)可突破基因治療的短期效應(yīng)限制。威尼德電穿孔儀的應(yīng)用使轉(zhuǎn)染效率提升至68.5%（傳統(tǒng)脂質(zhì)體法僅12-15%），且紫外交聯(lián)工藝保障了微囊結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。持續(xù)釋放的ANP通過(guò)激活cGMP-PKG通路，雙重作用于血管平滑肌松弛和鈉排泄調(diào)節(jié)，這與Western blot檢測(cè)到的主動(dòng)脈PKG1α上調(diào)2.7倍的結(jié)果一致。值得注意的是，微囊降解周期與降壓效應(yīng)時(shí)程高度匹配，提示可通過(guò)調(diào)整殼聚糖交聯(lián)度實(shí)現(xiàn)療效個(gè)性化調(diào)控。

結(jié)論

微囊化ANP cDNA轉(zhuǎn)染技術(shù)通過(guò)威尼德電穿孔儀實(shí)現(xiàn)高效靶向遞送，顯著降低SHR血壓并改善血管內(nèi)皮功能，且具備良好生物安全性。該體系為高血壓的基因治療提供了可轉(zhuǎn)化方案，未來(lái)可拓展至其他心血管活性肽的遞送研究。

參考文獻(xiàn)

1. Lin, K.-F.,Chao, J.,Chao, L..Atrial Natriuretic Peptide Gene Delivery Attenuates Hypertension, Cardiac Hypertrophy, and Renal Injury in Salt-Sensitive Rats[J].Human Gene Therapy.1998,9(10).

2. Kuei-Fu Lin,Julie Chao,Lee Chao.Human Atrial Natriuretic Peptide Gene Delivery Reduces Blood Pressure in Hypertensive Rats[J].Hypertension.1995,26(6).847-853.