摘要

基因表達(dá)譜芯片技術(shù)，系統(tǒng)分析β干擾素轉(zhuǎn)染人源細(xì)胞后反式調(diào)節(jié)基因的表達(dá)變化。通過(guò)威尼德電穿孔儀實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染，結(jié)合威尼德分子雜交儀完成基因表達(dá)譜檢測(cè)，篩選出差異表達(dá)基因并進(jìn)行功能富集分析。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明，β干擾素顯著調(diào)控多個(gè)參與免疫應(yīng)答和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因，為闡明其抗病毒及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制提供了新依據(jù)。

引言

β干擾素（IFN-β）是一類具有抗病毒、抗增殖及免疫調(diào)節(jié)功能的多效細(xì)胞因子，其生物學(xué)效應(yīng)主要通過(guò)激活JAK-STAT信號(hào)通路并誘導(dǎo)下游基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)。然而，β干擾素對(duì)細(xì)胞基因組的全局性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，尤其是非經(jīng)典反式調(diào)節(jié)基因的作用機(jī)制仍不明確?；虮磉_(dá)譜芯片技術(shù)因其高通量、高靈敏度的優(yōu)勢(shì)，成為系統(tǒng)解析基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理想工具。

HEK293細(xì)胞為模型，通過(guò)轉(zhuǎn)染β干擾素表達(dá)載體，結(jié)合威尼德紫外交聯(lián)儀和原位雜交儀完成樣本制備與檢測(cè)，旨在篩選β干擾素依賴的反式調(diào)節(jié)基因，并揭示其功能關(guān)聯(lián)，為深入解析β干擾素的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
人源HEK293細(xì)胞采用某試劑提供的DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）于37℃、5% CO?條件下培養(yǎng)。β干擾素表達(dá)載體（pIFN-β）通過(guò)威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，優(yōu)化參數(shù)為電壓150 V、脈沖時(shí)長(zhǎng)5 ms。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集細(xì)胞，以未轉(zhuǎn)染組及空載體轉(zhuǎn)染組為對(duì)照。

1.2 RNA提取與質(zhì)量控制
使用某試劑TRIzol法提取總RNA，經(jīng)威尼德分子雜交儀檢測(cè)RNA完整性（RIN值＞8.0），并通過(guò)某試劑cDNA合成試劑盒制備雙鏈cDNA。

1.3 基因表達(dá)譜芯片分析
采用某試劑Human Genome U133 Plus 2.0芯片進(jìn)行全基因組表達(dá)分析。標(biāo)記后的cDNA與芯片雜交后，通過(guò)威尼德紫外交聯(lián)儀固定，威尼德原位雜交儀進(jìn)行信號(hào)掃描。原始數(shù)據(jù)經(jīng)某試劑數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行背景校正、歸一化處理（RMA算法），篩選差異表達(dá)基因（Fold Change≥2，p<0.05）。

1.4 生物信息學(xué)分析
通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能注釋及KEGG通路富集分析，利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證
隨機(jī)選取10個(gè)差異基因，設(shè)計(jì)特異性引物，使用某試劑SYBR Green Master Mix在威尼德熒光定量PCR儀上驗(yàn)證表達(dá)水平。

2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 差異基因篩選
基因芯片共檢測(cè)到21,000個(gè)基因，其中β干擾素轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組相比，顯著差異表達(dá)基因328個(gè)（上調(diào)212個(gè)，下調(diào)116個(gè)）。

2.2 功能富集分析
GO分析顯示，差異基因主要富集于“I型干擾素信號(hào)通路"（p=3.2×10?1?）、“病毒防御反應(yīng)"（p=1.5×10??）及“細(xì)胞凋亡調(diào)控"（p=4.8×10??）。KEGG通路分析提示，差異基因顯著關(guān)聯(lián)于“Toll樣受體信號(hào)通路"和“RIG-I樣受體通路"。

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)
PPI網(wǎng)絡(luò)核心節(jié)點(diǎn)包括STAT1、IRF9、MX1等經(jīng)典干擾素誘導(dǎo)基因，同時(shí)發(fā)現(xiàn)新型調(diào)控基因CARD11、TRIM25等。

2.4 qPCR驗(yàn)證
10個(gè)候選基因的qPCR結(jié)果與芯片數(shù)據(jù)高度一致（R2=0.92），證實(shí)篩選結(jié)果的可靠性。

討論

基因表達(dá)譜芯片技術(shù)，系統(tǒng)揭示了β干擾素轉(zhuǎn)染細(xì)胞的反式調(diào)節(jié)基因譜。除已知的STAT1、IRF9等核心基因外，新發(fā)現(xiàn)的CARD11和TRIM25可能通過(guò)調(diào)控NF-κB通路參與免疫應(yīng)答，這一發(fā)現(xiàn)為β干擾素的非經(jīng)典作用機(jī)制提供了線索。實(shí)驗(yàn)采用威尼德電穿孔儀與分子雜交儀，確保了轉(zhuǎn)染效率及檢測(cè)靈敏度，為高通量基因篩選提供了技術(shù)保障。

結(jié)論

β干擾素調(diào)控的反式基因網(wǎng)絡(luò)，揭示了其通過(guò)多通路協(xié)同作用介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)的分子基礎(chǔ)。基于威尼德儀器的高效檢測(cè)體系為類似研究提供了可靠方法學(xué)參考。

參考文獻(xiàn)    

1. 基因表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選丙型肝炎病毒核心蛋白反式調(diào)節(jié)基因TAHCCP2的調(diào)節(jié)基因 [J] . 王建軍 ,劉妍 ,成軍 . 世界華人消化雜志 . 2004,第4期

2. 基因表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選乙型肝炎病毒核心蛋白結(jié)合蛋白基因C1反式調(diào)節(jié)基因 [J] . 藺淑梅 ,成軍 ,楊媛 . 西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版） . 2007,第002期

3. 應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選HCV p7蛋白反式調(diào)節(jié)基因 [J] . 郭江 ,成軍 ,洪源 . 中國(guó)肝臟病雜志（電子版） . 2010,第001期

4. 基因表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選乙型肝炎病毒X蛋白反式調(diào)節(jié)基因12 [J] . 宮嫚 ,成軍 ,劉妍 . 臨床薈萃 . 2007,第023期

5. 基因表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選NS5ATP2(615)蛋白反式調(diào)節(jié)基因 [J] . 楊瑗 ,楊倩 ,成軍 . 中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志 . 2005,第001期